如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)？如果這對(duì)通用引物沒有信號(hào)，就意味著這兩個(gè)位置有SNP，導(dǎo)致沒有擴(kuò)增?？梢詤⒖紟追N方法。1：你可能知道這種細(xì)菌的種類和屬，所以去NCBI找到相關(guān)種類的16S序列，做序列比對(duì)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引

如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)？

如果這對(duì)通用引物沒有信號(hào)，就意味著這兩個(gè)位置有SNP，導(dǎo)致沒有擴(kuò)增?？梢詤⒖紟追N方法。

1：你可能知道這種細(xì)菌的種類和屬，所以去NCBI找到相關(guān)種類的16S序列，做序列比對(duì)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)，然后測(cè)序。

2：你根本不了解物種。你可以在網(wǎng)上找到更多的入門知識(shí)。最好放大v3v4區(qū)或V4區(qū)。在放大了其中一些之后，你可以對(duì)它們進(jìn)行排序和比較。一般來(lái)說(shuō)，你可以確認(rèn)屬，然后按照1的方法。

3:如果部分序列可以通過(guò)方法2擴(kuò)增，但全長(zhǎng)引物未能擴(kuò)增，則將獲得的部分序列用作race。

4:以上所有操作均失敗。第二代的DNA被提取和測(cè)序，基因組被直接測(cè)量（如果你認(rèn)為成本太高，你可以減少數(shù)據(jù)量進(jìn)行比較）。

如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的引物？

您應(yīng)該使用嵌套PCR來(lái)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)。無(wú)論是在反轉(zhuǎn)錄前提取RNA還是直接從DNA中提取基因，考慮到模板的復(fù)雜性，都應(yīng)該使用巢式PCR。建議從靶基因的上下游設(shè)計(jì)一個(gè)外引物，然后根據(jù)靶基因的上下游設(shè)計(jì)一個(gè)內(nèi)引物。外引物不在目的基因上，但可以在目的基因上下游100bp以內(nèi)，利用引物設(shè)計(jì)可以找到最佳引物，提高首次PCR的成功率。第一個(gè)PCR產(chǎn)物用作第二個(gè)PCR的模板，因此如果產(chǎn)生了正確大小的P帶，就可以確定它是您的目標(biāo)帶。由于兩種特異性擴(kuò)增和大小正確，總特異性極高。另外，在第二個(gè)PCR過(guò)程中，模板是第一個(gè)PCR的產(chǎn)物，并且成分單一。不管內(nèi)部底漆有多差，都沒有問(wèn)題。這避免了“如果不能在CDs區(qū)域的兩端設(shè)計(jì)底漆怎么辦？”這就是問(wèn)題所在。你明白嗎？歡迎提問(wèn)！