同源重組中引物的設(shè)計(jì)為什么需要設(shè)計(jì)兩端引物？看你準(zhǔn)備用什么系統(tǒng)來(lái)做敲除了。原則上，不同系統(tǒng)對(duì)于同源臂長(zhǎng)度要求不同，根據(jù)這個(gè)來(lái)設(shè)計(jì)引物。做敲除一般啟動(dòng)子等元件無(wú)需考慮把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)

同源重組中引物的設(shè)計(jì)為什么需要設(shè)計(jì)兩端引物？

看你準(zhǔn)備用什么系統(tǒng)來(lái)做敲除了。原則上，不同系統(tǒng)對(duì)于同源臂長(zhǎng)度要求不同，根據(jù)這個(gè)來(lái)設(shè)計(jì)引物。做敲除一般啟動(dòng)子等元件無(wú)需考慮

把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)該如何選擇限制性?xún)?nèi)切酶?引物如何設(shè)計(jì)？

方法非常多，列舉一兩個(gè)：

1.

不同的粘性末端不能相連。所以，如果要相連，就要去除不同的粘性末端，進(jìn)行平末端相連。

粘末端變成平末端有兩種方法：klenow酶的補(bǔ)平或者s1核酸酶的切平。

為了減少載體自連，可以用堿性磷酸酶處理載體。

最后將載體和目的基因鏈接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.

設(shè)計(jì)引物，自帶酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增目的基因，直接改變目的基因的酶切位點(diǎn)，然后再用和載體相同的限制酶酶切目的基因，切出相同的粘性末端。

直接將酶切完成的目的基因和載體連接。